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本應(yīng)用采用美正MUTIPURE多功能凈化儀結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）建立了嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的檢測(cè)方法。

樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液提取，肝素親和柱富集凈化，C4色譜柱分離，外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，添加量為400 mg/kg時(shí)，乳鐵蛋白回收率在85% ~ 90%，能夠滿足檢測(cè)要求。

實(shí)驗(yàn)部分?

主要儀器設(shè)備

Aglient 1260高效液相色譜-紫外檢測(cè)器。

MUTIPURE多功能凈化儀。

試劑材料

0.1%三氟乙酸溶液：量取三氟乙酸1 mL，加水定容至1000 mL，混勻；

結(jié)合緩沖液：稱取30.083 g十二水合磷酸氫二鈉，2.496 g二水合磷酸二氫鈉，加900mL水溶解，加入20mL乳鐵蛋白提取試劑A（50倍濃縮液，肝素親和柱包裝盒中），最后用水定容至1000 mL混勻；

洗脫液：稱取7.52 g磷酸氫二鈉，0.624 g磷酸二氫鈉，29.2 g氯化鈉，加400 mL水溶解，定容至500 mL混勻；

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的乳鐵蛋白各0.1 g于10 mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度；

肝素親和柱：3 mL（P/N：QC0140）。

樣品制備

1、樣品提取

精確稱量2.5 g樣品于離心管內(nèi)，加入結(jié)合緩沖液30 mL，渦旋振蕩至樣本全部溶解，再加入結(jié)合緩沖液定容至50 mL，混勻，11000 r/min 4℃離心15 min，立即吸取25 mL中間層試液于另一50 mL離心管內(nèi)，11000 r/min 4℃離心15 min，立即取出中間層至15 mL離心管，恢復(fù)至室溫后待凈化。

2、樣品凈化

將上述待凈化液按順序連接上樣管，再取15 mL離心管依次置于收集架上，將肝素親和柱連接在MUTIPURE多功能凈化儀上（如下圖），按照下表的指令設(shè)置方法，啟動(dòng)儀器，由儀器自動(dòng)完成凈化步驟。

肝素親和柱連接在MUTIPURE多功能凈化儀

MUTIPURE多功能凈化儀儀器參數(shù)

后處理:渦旋混勻，離心5 min，取上清液上機(jī)待測(cè)。

色譜條件

色譜柱：DAISOPAK SP-300-5-C4-BI0，4.6 × 250 mm；

流動(dòng)相A?：0.1%三氟乙酸溶液；

流動(dòng)相B?:?乙腈；

柱??溫：30℃；

波 ?長(zhǎng)：280 nm；

進(jìn)樣量：30 μL；

流 ?速：1 mL/min；

梯度洗脫見(jiàn)下表。

液相色譜梯度洗脫條件

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳鐵蛋白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（添加水平400 mg/kg，n=4）

實(shí)驗(yàn)譜圖

40 μg/mL乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

嬰幼兒奶粉基質(zhì)空白色譜圖

400?mg/kg嬰幼兒奶粉基質(zhì)加標(biāo)色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用MUTIPURE多功能凈化儀結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測(cè)器對(duì)于加標(biāo)量為400 mg/kg的嬰幼兒奶粉進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果表明，使用MUTIPURE多功能凈化儀對(duì)嬰幼兒奶粉基質(zhì)進(jìn)行凈化，乳鐵蛋白回收率滿足要求且RSD小于10%，說(shuō)明MUTIPURE多功能凈化儀適用于嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的檢測(cè)，且方法穩(wěn)定。

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