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本應(yīng)用對飼料原料樣品（花生粕、豆粕、棉粕）中黃曲霉毒素B1(AFB1)、B2（AFB2）、G2（AFG2）,G2（AFG2）的檢測方法進行了驗證，通過對比不同前處理方法對黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2檢測結(jié)果的影響，確定了較佳的提取條件，采用自動化前處理儀器ASPE480免疫親和固相萃取系統(tǒng)，建立了免疫親和柱全自動凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料原料中黃曲霉毒素的測定方法。

結(jié)果表明：4種黃曲霉毒素在不同樣本中的回收率在82.2%～109.8%之間，精密度RSD小于8.9%。本方法可批量自動化處理樣品，提高工作效率，避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，可用于大量糧食飼料中真菌毒素的精準測定。

儀器及試劑

●??儀器設(shè)備：

AB SCIEX QTRAP 6500+四級桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀；

Waters Acquity超高效液相色譜，配備柱后衍生系統(tǒng)及熒光檢測器；

ASPE480全自動免疫親和固相萃取系統(tǒng)；

氮吹儀；

離心機。

●?試劑和耗材：

色譜純：甲醇、乙腈、甲酸。其他試劑如：氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀均為分析純；

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準溶液；

多功能凈化柱；

黃曲霉毒素免疫親和柱；

黃曲霉毒素磁性分子印跡微球。

?實驗條件

●?液相條件設(shè)置

色譜柱：Waters BEH C18柱（100 mm× 3.0 mm，1.7 μm）；柱溫：35℃；進樣量 5 μL；流動相流速：0.3 mL/min，梯度淋洗。

流動相梯度條件

●?質(zhì)譜條件設(shè)置

質(zhì)譜采用電子噴霧離子源，正離子掃描模式。噴霧電壓為5.5 Kv；毛細管溫度為500℃；脫溶劑氣為空氣、碰撞氣為高純氮氣，氣量為 50，50arb。具體的參數(shù)見下表。

質(zhì)譜掃描參數(shù)

●?固相萃取系統(tǒng)方法設(shè)置

按照如下方案，在ASPE480免疫親和固相萃取系統(tǒng)上設(shè)置方法。如下圖。

儀器方法-黃曲霉毒素B1

實驗方案

●?實驗樣本：

本實驗采用3種自然污染的黃曲霉毒素陽性樣本，為花生粕、豆粕、棉粕樣本。

●?方法考察：

不同提取溶劑對檢測結(jié)果的影響

選取9個自然污染的花生粕樣本、2個豆粕樣本、1個棉粕樣本和1個配合飼料樣本，分別使用84%的乙腈水溶液和80%的甲醇水溶液對上述樣品進行振蕩提取。提取溶液按照1:4的比例加入PBS溶液稀釋。稀釋液全部過免疫親和柱后，加水淋洗，甲醇洗脫。洗脫液氮吹近干，加1 mL50%甲醇溶液復(fù)溶，過0.22μm濾膜，上機檢測。

不同提取溶劑對餅粕樣品提取結(jié)果

對于花生粕、棉粕等飼料樣品中的黃曲霉毒素，84%的乙腈水溶液作為提取溶劑的檢測結(jié)果要顯著高于80%的甲醇水溶液的檢測結(jié)果，這表明對于餅粕類飼料樣品，84%乙腈溶液的提取效率要顯著高于80%甲醇。而對于配合飼料樣品，兩種溶劑的提取效果并不顯著。

不同凈化方法對檢測結(jié)果的影響

選取9個自然污染花生粕樣本、2個豆粕樣本和1個棉粕樣品，考察不同凈化方法對檢測結(jié)果的影響。實驗選擇85%的乙腈作為提取溶劑，以黃曲霉毒素免疫親和柱、真菌毒素多功能凈化柱、磁性分子印跡微球等三種凈化材料對提取溶液進行凈化處理，測定結(jié)果見下表：

不同提取溶劑對餅粕樣品提取結(jié)果

免疫親和柱凈化法的LC-MS/MS譜圖

磁性分子印跡凈化法的LC-MS/MS譜圖

?多功能凈化柱法的LC-MS/MS譜圖

使用三種不同的凈化方法處理樣品，其檢測結(jié)果基本一致，并無顯著差別。然而通過質(zhì)譜圖對比可知，使用免疫親和柱凈化法，所得譜圖干擾最少，凈化效果最佳。

方法驗證

以花生粕、豆粕及棉籽粕樣品為基礎(chǔ)進行空白添加實驗，驗證該方法的準確度和精密度。每種飼料原料樣品中添加3個濃度水平的黃曲霉素素，每個濃度設(shè)6個平行，計算回收率和變異系數(shù)，結(jié)果見表8。結(jié)果表明：在3個濃度添加水平下，平均回收率82.2%～109.8%之間，RSD值在1.9%-8.9%，方法的準確度和精密度均滿足要求。

不同飼料原料中添加4種黃曲霉毒素的回收率及精密度（n=6）

實驗結(jié)論

采用美正ASPE480免疫親和固相萃取系統(tǒng)，建立了免疫親和柱全自動凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生粕、豆粕和棉粕中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法。

結(jié)果標明：黃曲霉毒素B1在不同樣本中的回收率82.2%～109.8%之間，RSD小于8.9%，回收率和重現(xiàn)性良好。本方法可批量自動化處理樣品，節(jié)省操作時間，提高工作效率，避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，可用于大量糧食飼料中真菌毒素的精準測定。