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采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對(duì)致瀉大腸埃希氏菌（DEC）特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針。PCR擴(kuò)增過(guò)程中，與模板結(jié)合的探針被Taq酶分解產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)致瀉大腸埃希氏菌（DEC）在核酸水平上的菌株鑒定。

1、核酸提取????????

加熱法：刮取一環(huán)菌落，懸浮于100μL的無(wú)菌水中，漩渦震蕩10s（如果菌落未能均勻分散，可適當(dāng)延長(zhǎng)震蕩時(shí)間），95℃或沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，吸取上清。

試劑盒法：可使用商品化的試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA。

2、反應(yīng)體系配置

從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后各取模板5μL分別加入PCR管或PCR板中（每種模板要使用五種預(yù)混液），蓋好管蓋或板膜，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3、PCR擴(kuò)增???????

PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個(gè)循環(huán)60℃時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，檢測(cè)通道選擇FAM、HEX（VIC）、CY5。

注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均選擇“none”。