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采用實時熒光PCR技術(shù)，針對阪崎腸桿菌特異性基因設(shè)計引物和探針。PCR擴增過程中，與模板結(jié)合的探針被Taq酶分解產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號繪制出實時擴增曲線，從而實現(xiàn)阪崎腸桿菌在核酸水平上的定性檢測。

1、樣品處理

1）按照GB 4789.40-2016，取樣品100g（mL），加入到含有900mL預(yù)熱到44℃ BPW的無菌容器中均質(zhì)，調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。

2）36±1℃培養(yǎng)18-24h。

注：也可參考其他地方標準進行樣品的前處理。

2、核酸提取????????

1）取40μL增菌液于裂解液管中，98℃或沸水浴10min。

2）冷卻至室溫，吸取上清備用或者置于-20℃保存。

3、反應(yīng)體系配置

從試劑盒中取出ES預(yù)混液，充分融化，短暫離心，然后將陰性對照、樣品的DNA提取液、陽性對照各取5μL分別加入PCR管中，蓋好管蓋，短暫離心，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

4、PCR擴增???????

PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個循環(huán)60℃時檢測熒光信號，檢測通道選擇FAM。?

注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均選擇“none”。